Kromatografi

Macam-macam Kromatografi

Walaupun agak tidak terlalu jelas, kontribusi kromatografi pada perkembangan kimia modern tidak dapat dipandang rendah. Tanpa teknik kromatografi, sintesis senyawa murni (atau hampir murni) akan sangat sukar , dan dalam banyak kasus, hampir tidak mungkin.

Di awal abad ke-20, kimiawan Rusia Mikhail Semënovich Tsvet (1872-1919) menyiapkan kolom yang diisi dengan serbuk kalsium karbonat, dan kedalamnya dituangkan campuran pigmen tanaman yang dilarutkan dalam eter. Secara mengejutkan, pigmen memisahkan dan membentuk lapisan berwarna di sepanjang kolom. Ia menamakan kromatografi pada teknik pemisahan baru ini (1906). Kemudian kimiawan dari Swiss Richard Martin Willstätter (1872-1942) menerapkan teknik ini untuk risetnya yakni khlorofil untuk menunjukkan manfaat teknik ini, dan sejak itu banyak perhatian diberikan pada kromatografi.

Kromatografi adalah teknik untuk memisahkan campuran menjadi komponennya dengan bantuan perbedaan sifat fisik masing-masing komponen. Alat yang digunakan terdiri atas kolom yang di dalamnya diisikan fasa stasioner (padatan atau cairan). Campuran ditambahkan ke kolom dari ujung satu dan campuran akan bergerak dengan bantuan pengemban yang cocok (fasa mobil). Pemisahan dicapai oleh perbedaan laju turun masing-masing komponen dalam kolom, yang ditentukan oleh kekuatan adsorpsi atau koefisien partisi antara fasa mobil dan fasa diam (stationer).

Komponen utama kromatografi adalah fasa stationer dan fasa mobil dan kromatografi dibagi menjadi beberapa jenis bergantung pada jenis fasa mobil dan mekanisme pemisahannya,

a. Kromatografi partisi

Prinsip kromatografi partisi dapat dijelaskan dengan hukum partisi yang dapat diterapkan pada sistem multikomponen yang dibahas di bagian sebelumnya. Dalam kromatografi partisi, ekstraksi terjadi berulang dalam satu kali proses. Dalam percobaan, zat terlarut didistribusikan antara fasa stationer dan fasa mobil. Fasa stationer dalam banyak kasus pelarut diadsorbsi pada adsorben dan fasa mobil adalah molekul pelarut yang mengisi ruang antar partikel yang ter adsorbsi.

Contoh khas kromatografi partisi adalah kromatografi kolom yang digunakan luas karena merupakan sangat efisien untuk pemisahan senyawa organik (Gambar 12.3).

Kolomnya (tabung gela) diisi dengan bahan seperti alumina, silika gel atau pati yang dicampur dengan adsorben, dan pastanya diisikan kedalam kolom. Larutan sampel kemudian diisikan kedalam kolom dari atas sehingga sammpel diasorbsi oleh adsorben. Kemudian pelarut (fasa mobil; pembawa) ditambahkan tetes demi tetes dari atas kolom.

Partisi zat terlarut berlangsung di pelarut yang turun ke bawah (fasa mobil) dan pelarut yang teradsorbsi oleh adsorben (fasa stationer). Selama perjalanan turun, zat terlarut akan mengalami proses adsorpsi dan partisi berulang-ulang. Laju penurunan berbeda untuk masing-masing zat terlarut dan bergantung pada koefisien partisi masing-masing zat terlarut. Akhirnya, zat terlarut akan terpisahkan membentuk beberapa lapisan.

Akhirnya, masing-masing lapisan dielusi dengan pelarut yang cocok untuk memberikan spesimen murninya. Nilai R didefinisikan untuk tiap zat etralrut dengan persamaan berikut.

R = (jarak yang ditempuh zat terlarut) / (jarak yang ditempuh pelarut/fasa mobil).

Gambar 12.3 Diagram skematik kromatografi

b. Kromatografi kertas

Mekanisme pemisahan dengan kromatografi kertas prinsipnya sama dengan mekanisme pada kromatografi kolom. Adsorben dalam kromatografi kertas adalah kertas saring, yakni selulosa. Sampel yang akan dianalisis ditotolkan ke ujung kertas yang kemudian digantung dalam wadah. Kemudian dasar kertas saring dicelupkan kedalam pelarut yang mengisi dasar wadah. Fasa mobil (pelarut) dapat saja beragam. Air, etanol, asam asetat atau campuran zat-zat ini dapat digunakan.

Kromatografi kertas diterapkan untuk analisis campuran asam amino dengan sukses besar. Karena asam amino memiliki sifat yang sangat mirip, dan asam-asam amino larut dalam air dan tidak mudah menguap (tidak mungkin didistilasi), pemisahan asam amino adalah masalah paling sukar yang dihadapi kimiawan di akhir abad 19 dan awal abad 20. Jadi penemuan kromatografi kertas merupakan berita sangat baik bagi mereka.

Kimiawan Inggris Richard Laurence Millington Synge (1914-1994) adalah orang pertama yang menggunakan metoda analisis asam amino dengan kromatografi kertas. Saat campuran asam amino menaiki lembaran kertas secara vertikal karena ada fenomena kapiler, partisi asam amino antara fasa mobil dan fasa diam (air) yang teradsorbsi pada selulosa berlangsung berulang-ulang. Ketiak pelarut mencapai ujung atas kertas proses dihentikan. Setiap asam amino bergerak dari titik awal sepanjang jarak tertentu. Dari nilai R, masing-masing asam amino diidentifikasi.

Kromatografi kertas dua-dimensi (2D) menggunakan kertas yang luas bukan lembaran kecil, dan sampelnya diproses secara dua dimensi dengan dua pelarut.

Gambar 12.4 Contoh hasil kromatografi kertas pigmen dari

www.indigo.com/ science-supplies/filterpaper. html

c. Kromatografi gas

Campuran gas dapat dipisahkan dengan kromatografi gas. Fasa stationer dapat berupa padatan (kromatografi gas-padat) atau cairan (kromatografi gas-cair).

Umumnya, untuk kromatografi gas-padat, sejumlah kecil padatan inert misalnya karbon teraktivasi, alumina teraktivasi, silika gel atau saringan molekular diisikan ke dalam tabung logam gulung yang panjang (2-10 m) dan tipis. Fasa mobil adalah gas semacam hidrogen, nitrogen atau argon dan disebut gas pembawa. Pemisahan gas bertitik didih rendah seperti oksigen, karbon monoksida dan karbon dioksida dimungkinkan dengan teknik ini.

Dalam kasus kromatografi gas-cair, ester seperti ftalil dodesilsulfat yang diadsorbsi di permukaan alumina teraktivasi, silika gel atau penyaring molekular, digunakan sebagai fasa diam dan diisikan ke dalam kolom. Campuran senyawa yang mudah menguap dicampur dengan gas pembawa disuntikkan ke dalam kolom, dan setiap senyawa akan dipartisi antara fasa gas (mobil) dan fasa cair (diam) mengikuti hukum partisi. Senyawa yang kurang larut dalam fasa diam akan keluar lebih dahulu.

Metoda ini khususnya sangat baik untuk analisis senyawa organik yang mudah menguap seperti hidrokarbon dan ester. Analisis minyak mentah dan minyak atsiri dalam buah telah dengan sukses dilakukan dengan teknik ini.

Efisiensi pemisahan ditentukan dengan besarnya interaksi antara sampel dan cairannya. Disarankan untuk mencoba fasa cair standar yang diketahui efektif untuk berbagai senyawa. Berdasarkan hasil ini, cairan yang lebih khusus kemudian dapat dipilih. Metoda deteksinya, akan mempengaruhi kesensitifan teknik ini. Metoda yang dipilih akan bergantung apakah tujuannya analisik atau preparatif.

d. HPLC

Akhir-akhir ini, untuk pemurnian (misalnya untuk keperluan sintesis) senyawa organik skala besar, HPLC (high precision liquid chromatography atau high performance liquid chromatography) secara ekstensif digunakan. Bi la zat melarut dengan pelarut yang cocok, zat tersebut dapat dianalisis. Ciri teknik ini adalah penggunaan tekanan tinggi untuk mengirim fasa mobil kedalam kolom. Dengan memberikan tekanan tinggi, laju dan efisiensi pemisahan dapat ditingkatkan dengan besar.

Silika gel atau oktadesilsilan yang terikat pada silika gel digunakan sebagai fasa stationer. Fasa stationer cair tidak populer. Kolom yang digunakan untuk HPLC lebih pendek daripada kolom yang digunakan untuk kromatografi gas. Sebagian besar kolom lebih pendek dari 1 m.

Kromatografi penukar ion menggunakan bahan penukar ion sebagai fasa diam dan telah berhasil digunakan untuk analisis kation, anion dan ion organik.

1.      KROMATOGRAFI KERTAS

Merupakan salah satu jenis kromatografi yang paling sederhana. Prosenya dikenal swebagaianalisa kapiler. Metode ini sangat sesuai dengan kromatografi jerapan (adsorpsi) dimaa kertassebagai fase dan sekarang kromatografi kertas sebagai perkembangan dari partisi. Salah satuzat padat digunakan untuk menyokong fase adalah bubuk selulosa dari kertas.Keuntungan dari metode kromatografi kertas :Peralatan relatif sederhana dari KLT.Senyawa-senyawa yang terpisahkan dapat dideteksi lpada kertas dan segera diidentifikasi.Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam melakukan kromatografi kertas :Metoda :Ada 3 macam metoda kromatografi berdasarkan kedudukan kertas :a. Metoda penurunan (descending)- Alat yang pokok berupa bejana yang terbuat dari gelas, platina atau logam anti karat sertabertutup untuk mencegah penguapan dari pelarut. Agar kertas tidak lepas maka diberipenahan dari batang gelas.- Ujung kertas dicelupkan dalam fase gerak. Pertama kali fase gerak mengalir oleh gayakapiler, setelah melewati batang gelas maka aliranya disebabkan oleh gaya gravitasi.b. Metode penaikan (ascending)- kertas dicelupkan dalam fase gerak dan sempel tidak terendam. Fase gerak akan naikmelalui serat-serat dari kertas oleh gaya kapiler. Biasanya perambatan pelan dan makin lamamenurun karena gaya berat.c. Metode mendatar (horisontal)- Noda dicelupkan ditempatkan pada pusat dari kertas (umumnya kertas saring berbentukbulat) yang diberi sumbu. Aliran pelarut disebabkan oleh gaya kapiler. Kertas diletakansecara horisontal sehingga sumbu tercerlup pada fase gerak. Selanjutnya fase gerak bergerakke arah tepi kertas sambil membawa komponen-komponen campuran.- Bercak-bercak yang terjadi berupa garis lengkung dengan diameter makin panjang bilabercak makin ke tepi.Jenis kertas :Ada berbagai jenis kertas yang khusus dibuat untuk kromatografi yang berbeda dalamsusunan serat, ketebalan dan lain-lain.Jenis kertas antara lain mempengaruhi :- Kecepatan aliran eluen- Nilai Rf, karena daya serap berbeda-beda- Bentuk bercak zatUkuran kertas yang digunakan umumnya :Kromatografi menaik : panjang kertas sekitar 20 cmKromatografi menurun : panjang kertas sampai 50 cm atau lebihKromatografi mendatar sirkuler : diameter kertas 12 – 20 cm.Fase gerak :Eluen (disebut juga pelarut, cairan pengelusi, cairan pengembang, cairan penghantar) padakromatografi kertas biasanya merupakan campuran 2 komponen atau lebih.Pada gerak biasanya merupakan campuran yang terdiri dari satu komponen organik utama,air dan berbagai tambahan seperti asam, basa atau pereaksi-pereksi kompleks.

2. Sesungguhnya yang berlaku pada fase gerak adalah bagian campuran yang kurang populer.Faktor yang perlu diperhatikan terhadap fase gerak :a. Setelah pengembbangan fase gerak harus mudah diuapkan dan tidak boleh meninggalkansisa yang dapat mengganggu pengamatan bercak. Idealnya cairan eluen tidak bolehbercampur dalam fase diam atau sebaliknya.b. Fase gerak yang digunakan harus murni dan tidak boleh mengganggu pendeteksian bercak.Sebagai fase diam digunkan pelarut polar umumnya air.Sebagai fase gerak dapat digunakan alkhohol, asam-basa, keton, ester, amia, fenol,hidrokarbon atau campuran pelarut untuk mendapatkan pemisahan yang sempurna.Persipan sampelZat atau campuran yang diperiksa dilarutkan dalam pelarut yang sesuai, kemudian diletakanpada kertas dengan menggunakan pipa kapiler (mikropipet) atau syrine (jarum suntik).Titik penetasan zat kira-kira 2 cm dari bawah kertas pada metode penaikan. Pada metodepenurunan : pada jarak yang sesuai shingga letak titik beberapa cm di bawah fase gerak.Diameter penetasan berhubungan dengan tebal dan karakteristik jerapan dari kertas. Semakinkecil noda akan menghasilkan pemisahan yang baik.Penempatan sempel pada kertas yang penting bukan pada jumlah volume tetapi tergantungbanyaknya campuran yang tertinggal bila pelarut telah teruapkan, maka sempel atau zat dapat“ dipekatkan” bila terlalu encer dengan cara penetesan berulang setelah tetesan sebelumnyakering dengandikering udarakan.Waktu pengembangan (Elusi)Pengembang dilakukan setelah fase gerak (elulen) ditempatkan pada bejana yang cocok.Bejana dijenuhkan dengan fase uap gerak dengan cara menutup dan didiamkan beberapawaktu (jam). Penjenuhan akan lebih baik dengan cara meletakan kertas saring yang dibasahifaase gerak pada dinding bejana.Ujung kertas dicelupkan dalam fase gerak dan dijaga agar noda agar tidak tetap tidakterendam dan kertas tidak menyentuh dinding bejana. Jarak pengembangan, pada metodepenaikan biasanya 15 cm dan pada metode penurunan dapat berfariasi.Metode deteksi dan identifikasiUntuk senyawa yang tidak berwarna diperlukan deteksi secara kimia atau fisika.Secara fisika : misal dengan sinar ultra violet (panjang gelombang 254 dan 370 mm)Secara kimia : dengan menyemprotkan pereaksi pada kertas atau mencelupkan padsa kertaspeda larutan pereaksi. Pereaksi tersebut dikenal sebagai pereaksi lokasi atau pereaksi spesifik.KROMATOGRAM :Kromatogram (hasil pemisahan zat oleh elusi pada kromatografi kertas berupa bercak yangmenunjukan ” letak ” zat. Tiap pada sistem kromatogram tertentu menghasilkan :Jarak ynag ditempuh oleh zat yang bersangkutan dititik awalNilai Rf :Jarak yang ditempuh oleh elusi dititik awalNilai Rf disebut juga faktor Retardasi = Rate of fraction.Pada sistem kromatografi dan kondisi elusi tertentu, tiap-tiap zat dapat dikenal melalui NilaiRf nya yang sebagai suatu tetapan kimia fisika.Fakto-faktor yang mempengaruhi nilai Rf antara lain :1. Jenis dan mutu kertas, daya jerap, kelembaban.2. Susunan pelarut, meliputi :

3. a. Kemurnian pelarutb. Stabilitas campuran pelarut selama pemakain dan penyimpanan3. temperatur ruang4. kelembaban ruang5. Kejenuhan ruang akan uap pelarut6. Konsentrasi (banyaknya) zat7. Jarak bercak awal (tempat penetesan zat) kepermukaan pelarut8. Adanya zat lain atau pencemaranUntuk mengurangi pengaruh fakto-faktor yang sukar diatur tersebut maka seringkaliditentukan nilai Rx statu zat A terhadap zat x sebaga pembangding.Rf zat ANilai Rx =Rf zat XNilai Rx diharapkan tetap karena kedua nilai Rf diperoleh pada kondisi kromatografi yangsama

2.      Kromatografi kolom adalah salah satu metode yang digunakan untuk pemurnian senyawa dari campuran dengan memakai kolom. Kromatografi kolom termasuk kromatografi preparatif.

Peralatan Kromatografi Kolom

Alat utama yang digunakan adalah sebuah tabung dengan diameter 5-50 mm dan tinggi 5 cm - 1 m. Pada bagian dasar tabung diberi semacam penyaring dari glass wool untuk menghindari hilangnya fasa diam.

Fasa gerak

Fasa gerak atau eluen adalah campuran cairan murni. Eluen dipilih sedemikian rupa sehingga faktor retensi senyawa berkisar antara 0,2-0,3 supaya meminimalisasi penggunaan waktu dan jumlah eluen melewati kolom. Jenis eluen yang digunakan pada kromatografi kolom dipilih supaya senyawa yang berbeda dapat dipisahkan secara efektif. Eluen yang digunakan dapat dicoba terlebih dahulu menggunakan kromatografi lapis tipis. Setelah dirasa cocok, eluen yang sama digunakan untuk mengelusi komponen dalam kolom.

Fasa diam

Fasa diam yang digunakan dalam kromatografi kolom adalah suatu adsorben padat. Biasanya berupa silika gel atau alumina. Dahulu juga sering digunakan bubuk selulosa. Fasa diam berbentuk serbuk microporous untuk meningkatkan luas permukaan.

Metode

Dua metode utama yang digunakan yaitu metode kering dan metode basah:

Metode kering

Pada metode kering, kolom diisi dengan fasa diam kering, diikuti dengan penambahan fasa gerak yang disiramkan pada kolom sampai benar-benar basah.

Metode basah

Pada metode basah, bubur (slurry) disiapkan dengan mencampurkan eluen pada serbuk fasa diam dan dimasukkan secara hati-hati pada kolom. Dalam langkah ini harus benar-benar hati-hati supaya tidak ada gelumbung udara. Larutan senyawa organik dipipet di bagian atas fasa diam, kemudian eluen dituangkan pelan-pelan melewati kolom.

Cara Kerja Kromatografi Kolom

Komponen tunggal ditahan pada fasa diam berupa adorben karena telah terikat. Ketika eluen dialirkan, maka senyawa akan melakukan migrasi, terbawa oleh eluen sesuai dengan kesesuaian kepolaran. Masing-masing senyawa dalam komponen mempunyai kecepatan yang berbeda-beda dalam melewati kolom. Selama proses berlangsung, akan didapatkan beberapa fraksi. Masing-masing fraksi kemungkinan mengandung senyawa yang berbeda. Untuk mengujinya, fraksi hasil kromatografi kolom dapat diamati menggunakan KLT. Fraksi dengan Rf yang mirip, kemungkinan mengandung senyawa yang sama. Fraksi dapat diamati lebih lanjut menggunakan spektroskopi.

Seluruh proses kromatografi kolom dapat dilihat pada gambar berikut:

Sumber: http://www.ilmukimia.org/2013/05/kromatografi-kolom.html

3.Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi lapis tipis (KLT) adalah salah satu metode pemisahan komponen menggunakan fasa diam berupa plat dengan lapisan bahan adsorben inert. KLT merupakan salah satu jenis kromatografi analitik. KLT sering digunakan untuk identifikasi awal, karena banyak keuntungan menggunakan KLT, di antaranya adalah sederhana dan murah. KLT termasuk dalam kategori kromatografi planar, selain kromatografi kertas.

Peralatan KLT

Kromatografi lapis tipis menggunakan plat tipis yang dilapisi dengan adsorben seperti silika gel, aluminium oksida (alumina) maupun selulosa. Adsorben tersebut berperan sebagai fasa diam.

Fasa gerak yang digunakan dalam KLT sering disebut dengan eluen. Pemilihan eluen didasarkan pada polaritas senyawa dan biasanya merupakan campuran beberapa cairan yang berbeda polaritas, sehingga didapatkan perbandingan tertentu. Eluen KLT dipilih dengan cara trial and error.Kepolaran eluen sangat berpengaruh terhadap Rf (faktor retensi) yang diperoleh.

Faktor Retensi

Faktor retensi (Rf) adalah jarak yang ditempuh oleh komponen dibagi dengan jarak yang ditempuh oleh eluen. Rumus faktor retensi adalah:

Rf KLT

Nilai Rf sangat karakterisitik untuk senyawa tertentu pada eluen tertentu. Hal tersebut dapat digunakan untuk mengidentifikasi adanya perbedaan senyawa dalam sampel. Senyawa yang mempunyai Rf lebih besar berarti mempunyai kepolaran yang rendah, begitu juga sebaliknya. Hal tersebut dikarenakan fasa diam bersifat polar. Senyawa yang lebih polar akan tertahan kuat pada fasa diam, sehingga menghasilkan nilai Rf yang rendah.

Rf KLT yang bagus berkisar antara 0,2 - 0,8. Jika Rf terlalu tinggi, yang harus dilakukan adalah mengurangi kepolaran eluen, dan sebaliknya.

Cara Menggunakan KLT

KLT sangat berguna untuk mengetahui jumlah komponen dalam sampel. Peralatan yang digunakan untuk KLT adalah chamber (wadah untuk proses KLT) , pinset, plat KLT, dan eluen. Inilah langkah-langkah memakai KLT:

1.      Potong plat sesuai ukuran. Biasanya, untuk satu spot menggunakan plat selebar 1 cm. Berarti jika menguji 3 sampel (3 spot) berarti menggunakan plat selebar 3 cm.

2.      Buat garis dasar (base line) di bagian bawah, sekitar 0,5 cm dari ujung bawah plat, dan garis akhir di bagian atas.

3.      Menggunakan pipa kapiler, totolkan sampel cairan yang telah disiapkan sejajar, tepat di atas base line. Jika sampel padat, larutkan pada pelarut tertentu. Keringkan totolan.

4.      Dengan pipet yang berbeda, masukkan masing-masing eluen ke dalam chamber dan campurkan.

5.      Tempatkan plat pada chamber berisi eluen. Base line jangan sampai tercelup oleh ulen. Tutuplah chamber.

6.      Tunggu eluen mengelusi sampel sampai mencapai garis akhir, di sana pemisahan akan terlihat.

7.      Setelah mencapai garis akhir, angkat plat dengan pinset, keringkan dan ukur jarak spot. Jika spot tidak kelihatan, amati pada lampu UV. Jika masih tak terlihat, semprot dengan pewarna tertentu seperti kalium kromat atau ninhidrin.

Untuk lebih jelasnya, perhatikan gambar di bawah ni.

proses KLT

Sumber :

http://www.chem-is-try.org/materi_kimia/kimia_dasar/pemurnian-material/kromatografi/

http://susanblogs18.blogspot.com/2012/11/makalah-klasifikasi-metode-kromatografi.html#ixzz2PRQWI3FP